免疫學檢測
機體感染梅毒螺旋體后，經(jīng)過一定潛伏期，血清中可產(chǎn)生一定數(shù)量的抗類脂質抗體(非特異性的血清反應素)和抗梅毒螺旋體抗體(特異性的免疫球蛋白)，用血清學試驗檢測患者血清中的反應素或抗體是診斷梅毒的最主要的實驗室檢查方法，根據(jù)檢測試劑中所用抗原不同可分為兩類，一類為非梅毒螺旋體抗原試驗，另一類為梅毒螺旋體抗原試驗。
1.非梅毒螺旋體抗原試驗這類試驗的抗原為心磷脂、卵磷脂和膽固醇的混懸液，用來檢測血清中抗心磷脂抗體。此類試驗為非特異性抗體檢測試驗，為梅毒的常規(guī)篩查試驗。美國CDC認可的磷脂抗體檢測實驗包括VDRL、USR、RPR、TRUST.
(1)研究實驗室玻片試驗<veneraldiseaseresearchlabo-ratorytest，vdrl)
vdrl試驗所用抗原是從牛心中提取心磷脂，適量加入膽固酵及卵磷脂以提高敏感性，通常稱這種抗原為心磷脂抗原。梅毒螺旋體在破壞組織的過程中，體內釋放一種抗原性心磷脂，它刺激機體產(chǎn)生反應素，這種反應素與牛心中提取的心磷脂在體外發(fā)生抗原抗體反應。< p="">
1)檢測方法
有定性試驗與定量試驗。
2)診斷意義及評價
①可作定量及定性試驗，操作簡單.報告快速，費用低，并有一定的敏感性和特異性，可用于標本的初篩及作為療效觀察、隨訪的指標;②是唯一推薦用于檢測腦脊液反應素的試驗，對診斷神經(jīng)梅毒具有重要價值;③某些生物學因素及某些疾病(如結締組織病、感染性疾病等)存在時可能出現(xiàn)假陽性;④操作不正確或由于抗體過剩引起的前帶效應，可導致假陰性反應;⑤本法對一期梅毒敏感性不高;⑥應用顯微鏡讀取結果。
(2)不需加熱血清反應素試驗(unheatedserumregaintest，USR)
該試驗用改良的VDRL抗原，稀釋后離心沉淀，于沉淀中加入二胺四乙酸二鈉(EDTA)、防腐劑，并加入氯化膽堿起化學“滅活”作用。待檢血清不必滅活。
1)檢測方法
有定性試驗和定量試驗。
2)診斷意義及評價
?、倏勺鳛榀熜в^察、隨訪、有否復發(fā)或再感染指征。
②USR試驗所用抗原是VDRL抗原的改良，敏感性及特異性與VDRL相似。
?、墼诓Ｆ献鲂鯛罘磻?，可肉眼讀取結果。
?、苎宀恍杓訜釡缁?，抗原懸液可保存4個月，不需即時配制，節(jié)省操作時間。
(3)快速血漿反應環(huán)狀卡片試驗(rapidplasmareagincardtest，RPR)
RPR是80年代問世的非特異性梅毒血清學試驗，所用抗原為標準的牛心肌脂抗原，該法操作簡便、快速。原理與USR試驗基本相同，由于在RPR抗原中加入了活性碳顆粒.試驗在特制的白色紙卡上進行，所以容易判斷結果。是目前實驗室最常用的梅毒篩選實驗。
1)檢測方法
有定性試驗與定量試驗。
2)診斷意義及評價
①該法操作簡便、迅速，適用于大量標本檢測。
?、陟`敏度較VDRL高，特別是在早期梅毒。主要用于Ⅰ期梅毒的診斷。
?、劢Y果容易判定、不需滅活、不需顯微鏡，抗原不需新鮮配制等。
?、芏ㄐ栽囼炾栃远急仨氉龆吭囼?，陽性者需了解抗體效價的高低，以便監(jiān)視疾病活動情況和觀察療效。
?、莓斂贵w含量過高時，可出現(xiàn)“前帶現(xiàn)象”導致陰性反應;定量試驗還可排除“前帶現(xiàn)象”。
?、弈承┥飳W因素及某些疾病可導致生物學假陽性反應。
(4)甲苯胺紅不加熱血清反應素試驗(TRUST)
本試驗所用的抗原是從牛心提取的心磷脂和從雞蛋黃提取的卵磷脂及膽固醇，與RPR方法比較，是在TRUST抗原中加人甲苯胺紅染料顆粒代替碳顆粒作為指示物，使陽性結果出現(xiàn)紅色絮狀凝集現(xiàn)象。其操作方法、結果判讀與檢測意義與RPR相同。其缺點是許多因素可影響測定結果，如高脂血癥和抗心磷脂抗體陽性患者的血清均可干擾而出現(xiàn)假陽性結果。而且該試驗在非淋菌性尿道炎患者中存在生物學假陽性。
(5)康_華氏試驗
是最早采用的梅毒血清學試驗。這兩種試驗的抗原采自牛心肌乙醇浸液，稱作心肌脂抗原。此類試驗操作復雜，易出現(xiàn)假陽性?，F(xiàn)已被淘汰。
2.梅毒螺旋體抗原試驗此類試驗采用的抗原是梅毒螺旋體，檢測血清中的抗梅毒螺旋體IgM或IgG抗體，其敏感性和特異性均較高。常用的方法有梅毒螺旋體血球凝集試驗、梅毒螺旋體熒光抗體吸收試驗、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗、梅毒螺旋體免疫印跡試驗、梅毒螺旋體制動試驗等。
(1)梅毒螺旋體微量血凝試驗(mierohemagglutinationassayforantibodiestoTreponemapallidumMHA-TP)
是以梅毒螺旋體為抗原的間接血球凝集試驗，用于檢測血清中特異性梅毒螺旋體抗體，是目前國內常用的梅毒血清學確證試驗。所用抗原為經(jīng)超聲渡處理的Nichol梅毒螺旋體提取物，再經(jīng)醛化和鞣酸處理的綿羊紅細胞致敏，稱為致敏血球。待檢血清用吸附劑處理，吸附劑是用非致病性螺旋體Reiter株經(jīng)培養(yǎng)繁殖一定量后，高壓滅菌，高速離心而得。待檢血清經(jīng)吸收處理后，可除去非特異性螺旋體抗體。
診斷意義及評價
?、賂PHA的敏感性和特異性均較高?是梅毒的權威性診斷方法。
?、诓僮骱唵?，血清血漿均可檢測，結果清晰易判斷。
?、墼撛囼炓坏╆栃?，約95%患者終身不轉陰，因此該試驗陽性只能說明患過梅毒，不能作為療效觀察及隨訪指征。
?、茉噭┏杀据^高，結果判斷難以自動化。
(2)梅毒螺旋體熒光抗體吸收試驗(fluoresceneetrepo-nemaantibodyabsorptiontest，F(xiàn)TA-ABS)
該法以密螺旋體無毒株(Reiter株)抗原吸收待檢血清，排除同屬抗原的交叉結合，保證了試驗結果的特異性;以整條梅毒螺旋體檢測血清中抗體，確保各種抗原分子的完整存在，提高了試驗的敏感性。美國常采用此試驗作為梅毒的確認試驗。
診斷意義及評價
?、貴TA-ABS具有特異性高、敏感性較強的特點，被認為是檢測梅毒的“金標準”。
?、谠撛囼炓坏╆栃?，約95%患者終身不轉陰，因此該指標陽性只能說明患過梅毒，不能作為療效觀察及隨訪指標。
?、坌栌袃?yōu)質的熒光顯微鏡和技術熟練的操作人員，試驗結果判定常帶有主觀色彩。不作為梅毒診斷的首選方法。
④血清標本陳舊與污染、操作不準確等可引起的假陽性。
?、菁t斑性狼瘡、麻風、類風濕性關節(jié)炎、混合結締組織病、海洛因成癮等可引起假陽性反應。
(3)梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmu-nosorbentassay，TPELISA)
是近年來隨著梅毒螺旋體基因工程抗原的研制成功而建立的方法。該法用雙抗原夾心法測定梅毒特異性抗體，主要檢測梅毒螺旋體IgG和IgM抗體，國內外的研究也表明，TP-ELISA和TPHA、FTA-ABS等有良好的相關性。該法操作簡便，不受樣品中纖維蛋白(原)和溶血等影響，一次可進行多份樣品的檢測，用酶標儀分析，客觀準確，結果便于保留及標準化管理，可用作篩查和確認試驗。因此，TP-ELISA方法被公認為梅毒血清學診斷實驗的首選方法。
1)檢測方法
利用間接法ELISA的原理，把抗人IgG或IgM單克隆抗體包埋在微量滴定板或其它固相載體上，加人待檢血清以捕捉其中的IgG或IgM，再先后加人超聲粉碎或基因重組獲得的梅毒螺旋體抗原、生物素標記的抗梅毒螺旋體單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的親和素及底物，最后通過顯色判定結果。
2)診斷意義及評價
?、倏梢詼yIgG和IgM抗體，是對早期梅毒、胎傳梅毒診斷有重要意義。
?、贓LISA方法易自動化，適用于大量標本的檢測。
(4)梅毒螺旋體免疫印跡試驗(westernimmunoblottingtechnique)
是20世紀80年代發(fā)展起來的一種檢測技術。該試驗通過轉移電泳制備的硝酸纖維膜條上含有梅毒螺旋體的蛋白以確認是否梅毒感染。
診斷意義及評價
?、倜庖哂≯E法結合了免疫學和分子生物學的特點，敏感性高，特異性強。
?、谠摲ú僮骱啽?，對試驗儀器和環(huán)境的要求不高，結果容易判定，但成本較高。
?、凼窃缙诿范尽⑻髅范竞童熜в^察的十分敏感和特異的方法。
(5)梅毒螺旋體制動試驗(treponemapallidumimmobi-lization，TPI)
用活的Nichol株螺旋體加患者血清(含抗體)后，在補體的參與下可抑制螺旋體的活動。如≥50%梅毒螺旋體停止活動，則為陽性。此試驗特異性、敏感性均高，但設備要求高，操作難，僅供研究用。
3.梅毒血清學試驗的應用評價
(1)非梅毒螺旋體抗原試驗應用價值
?、龠m用于常規(guī)檢查及大量人群篩選。
②定量試驗可監(jiān)測疾病活動情況和觀察治療效果，輔助判斷是否復發(fā)與再感染。
③鑒別早期梅毒與晚期潛伏梅毒，先天梅毒與被動反應素血癥。
?、苣X脊液作VDRL試驗，有助于神經(jīng)梅毒的診斷。
⑤非梅毒螺旋體抗原試驗陽性者，要用梅毒螺旋體抗原試驗確認。
(2)梅毒螺旋體抗原試驗應用價值
?、儆没畹幕蛩赖拿范韭菪w或其成分作抗原測定抗螺旋體抗體。這種試驗敏感性和特異性均高，一般用作證實試驗。
?、诩词够颊呓?jīng)過足夠的抗梅毒治療，此類血清學反應仍可保持陽性，甚至保持終生，因此，不能用于觀察療效。
(3)血清中抗梅毒螺旋體IgM型抗體檢測
血清中的抗梅毒螺旋體IgG抗體，即使是患者經(jīng)過足夠治療后，仍能長期存在，甚至終身不消失。血清反應持續(xù)陽性，只能作為流行病學檢測。血清中的抗梅毒螺旋體IgM抗體是早期梅毒、活動性梅毒、再染性梅毒的標志，可用來監(jiān)測病情，指導治療和判斷愈后，并可以診斷先天梅毒和活動性神經(jīng)梅毒。
(4)梅毒血清反應的假陽性
?、偌毙陨飳W假陽性
一般出現(xiàn)于非螺旋體抗原血清試驗，見于麻疹，水痘、風疹、傳染性單核細胞增多癥、上呼吸道感染、猩紅熱、亞急性細菌性心內膜炎、肺炎鏈球菌性肺炎、活動性肺結核、絲蟲病、斑疹傷寒、錐蟲病、回歸熱、鉤端螺旋體、瘧疾等，但滴度較低，一般在1：8以下。往往在6個月內轉陰。
?、诼陨飳W假陽性
可持續(xù)6個月以上或數(shù)年，甚至終身。多數(shù)出現(xiàn)于非螺旋體抗原血清試驗假陽性，常見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、播散性盤狀紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血、進行性系統(tǒng)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病，滴度可達1：64～1：128;少數(shù)孕婦、正常人群假陽性率為1%～2%。在70歲以上高齡老人中有1%出現(xiàn)假陽性。螺旋體抗原血清假陽性發(fā)生率比非螺旋體抗原血清試驗少，少數(shù)患者出現(xiàn)FTA—ABS假陽性，其熒光染色常很弱或呈不典型的“串珠狀”。
③技術性假陽性
可能的原因為抗原敏感性過高，血清標本弄錯或溶血或細菌污染，工作人員的技術不熟練等。技術性誤差引起的假陽性，應排除可能存在的干擾因素，重新檢測。
(5)梅毒血清反應假陰性可能的原因是
?、僖黄诿范居蚕吗幔话阌蚕吗岢霈F(xiàn)2～3周，機體才出現(xiàn)反應素，故早期血清反應常呈陰性。
?、诟腥久范竞罅⒓粗委熁蛲砥诿范荆捎谘宸磻氐?，出現(xiàn)陰性。
③二期梅毒假陰性：這是血清中抗心磷脂抗體過多，抑制陽性反應的結果。即前帶現(xiàn)象(prozonephenomenon)。
?、芗夹g操作或抗原敏感性低出現(xiàn)血清試驗陰性。
微生物學檢測
1.梅毒病原體的檢測梅毒螺旋體一般染料不易著色，常采用鍍銀染色、熒光染色后檢測。用暗視野顯微鏡也可從病變標本中直接觀察到梅毒螺旋體。
(1)暗視野顯微鏡檢查梅毒螺旋體(DF)
暗視野顯微鏡檢查采用一個特殊的聚光器，其中央為黑色遮光板所遮蔽，光線不能直接通向鏡筒，僅可從其四周邊緣斜射到載玻片上。如該斜射光線遇到載玻片上的細菌、螺旋體等，由于菌體和周圍液體折光率不同，物體在暗視野內由于折射顯現(xiàn)發(fā)光。暗視野顯微鏡檢查是梅毒病原體檢測的主要方法之一，可直接觀察到病灶分泌物中的梅毒螺旋體，結合臨床癥狀可直接診斷梅毒。
1)標本采集和處理
?、倨つw黏膜損害：先在載玻片上放1～2滴9g/L氯化鈉溶液。另用棉拭子蘸取無菌9g/L氯化鈉溶液輕輕擦盡皮損上的污物(如皮損上有痂皮，可用鈍刀輕輕除去)，用手擠壓皮損周圍，使組織漿液滲出，用鈍刀輕輕刮取數(shù)次(避免出血)，取滲液混入載玻片上9g/L氯化鈉溶液中，加蓋玻片后置暗視野顯微鏡下檢查。
?、诹馨徒Y：消毒淋巴結表面的皮膚，用1ml無菌注射器吸取無菌9g/L氯化鈉溶液0.25～0.50ml，無菌操作穿刺淋巴結并注人9g/L氯化鈉溶液，再吸人注射器內。如此反復2～3次后，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上，加蓋玻片，置暗視野顯微鏡檢查。
?、垩蛩好范驹袐D的羊膜穿刺術應由專業(yè)人員操作，獲得羊水直接滴于載玻片上，加蓋玻片，置暗視野顯微鏡檢查。
2)檢測方法
將顯微鏡聚光器換上暗視野聚光器，將標本置載物臺上，先用10倍物鏡，再用40倍物鏡觀察。調整聚光器的高度要適中，使物像清晰為度。暗視野顯微鏡下，螺旋體呈纖細螺旋狀，長約5～20μm，有6～12個螺旋。見到運動活潑的螺旋體即為陽性。
3)診斷意義及評價
?、僭摲椒ú粌H操作簡單，且經(jīng)濟、快速，陽性結果可以確診梅毒，陰性結果不能完全除外梅毒。
②對有皮膚黏膜損害和淋巴結病變的一期、二期梅毒的診斷具有重要價值，適用于早期梅毒的診斷。
?、垩蛩畽z查對先天性梅毒診斷有重要價值。
?、苡盟帯⑷〔牟划?shù)容^多因素可影響檢查結果。
?、荽朔ú贿m用于晚期及隱性梅毒或口腔、肛周等部位標本的檢測。
(2)免疫熒光染色法
含梅毒螺旋體抗體血清，加非致病性螺旋體培養(yǎng)物進行吸收，再與異硫氰酸熒光素(HTC)相結合，梅毒螺旋體在熒光顯微鏡下呈綠色熒光，易于觀察。
1)檢測方法
分直接免疫熒光法和間接免疫熒光法。
2)診斷意義及評價
①免疫熒光法的診斷價值與暗視野顯微鏡檢查法相似。靈敏性稍高于暗視野檢查。
?、诿庖邿晒饪贵w法檢查既可以檢測皮損分泌物，又可以檢測新鮮或甲醛固定組織中的梅毒螺旋體。
?、勖庖邿晒饪贵w法陽性結果可確診為梅毒，陰性結果不能完全除外梅毒，因為標本、FITC、抗血清質量以及操作技術等方面的影響均可能導致假陰性結果。
?、芸捎糜诳谇弧⒏刂艿炔课粯吮局忻范韭菪w的檢測。
(3)螺旋體鍍銀染色法
螺旋體具有親銀性。硝酸銀可使之染成棕黑色。
1)檢測方法
取材、涂片后在空氣中自然干燥，羅吉固定液固定1～2分鐘，無水乙醇洗滌，滴媒染液2～3滴，用乙醇燈微加熱至產(chǎn)生熱蒸汽為止，染30秒后水洗，最后滴加銀染液并加熱產(chǎn)生蒸汽，染30秒后水洗，自然干燥后置油鏡下鏡檢。背景為淡棕色，螺旋體被染成棕黑色。
2)診斷意義及評價
?、訇栃越Y果結合典型的皮膚黏膜損害可確診梅毒，但陰性結果不能完全除外梅毒。
②有時某些腐生螺旋體亦呈假陽性反應。
?、墼摲ㄟm用于缺乏暗視野顯微鏡的基層單位直接檢查梅毒螺旋體。
(4)多功能顯微診斷儀(multifunctionmicroscopydiagnosticinstrument，MDI)
是近年發(fā)展的一種綜合相差對比、暗視野及偏振光的可變投影顯微鏡，待檢標本不需染色及任何加工處理，而是將“活的”真實的樣品直接進行觀察，具有直接、方便、快速的優(yōu)點。但整套儀器價格昂貴.很難普及到各個梅毒檢測實驗室。
2.基因診斷技術檢測梅毒螺旋體不能進行體外培養(yǎng)，血清學診斷對確定感染及治療很有意義。但對早期梅毒診斷不敏感，對先天性及神經(jīng)性梅毒的診斷不夠特異。隨著基因診斷技術的發(fā)展，PCR技術應用于檢測梅毒螺旋體DNA，特異性強，敏感性高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進方法。
(1)標本采集和處理
可采集局部分泌物、淋巴結液、羊求、血清、腦脊液等標本，用煮沸或低速離心或堿裂解等方法從標本中提取DNA模板。
(2)檢測方法
PCR檢測梅毒螺旋體時，一般使用梅毒螺旋體47kD膜抗原基因(tpp47基因)，39kD堿性膜蛋白基因(bmp基因)，TpF1蛋白基因(tpf-1)或TyF1蛋白基因(tyf-1)和tmpA基因，PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色進行鑒定。
(3)診斷意義及評價
1)敏感性和特異性較高，尤其對無臨床表現(xiàn)、血清學為陰性的可疑梅毒、神經(jīng)性梅毒、胎傳梅毒等具有較好的輔助診斷價值。
2)不能區(qū)分恬的和死的螺旋體，一般不用于梅毒治療后的復查。但死亡的梅毒螺旋體經(jīng)15～30天即從機體內清除，故治療數(shù)周后PCR陽性意昧著持續(xù)感染的可能。
3.腦脊液檢查晚期梅毒患者，當出現(xiàn)神經(jīng)癥狀時.要進行腦脊液檢查.以診斷或排除神經(jīng)梅毒。
(1)細胞計數(shù)
腦脊液白細胞計數(shù)也常常是判斷療效的敏感指標。當有活動的神經(jīng)梅毒存在時，腦脊液白細胞計數(shù)常增高，WBC>5/μl。
(2)蛋白測定
神經(jīng)梅毒時，腦脊液總蛋白量增加此為非特異性變化。
(3)VDRL試驗
為診斷神經(jīng)梅毒的可靠診斷依據(jù)。
(4)腦脊液PCR檢測
可快速準確診斷神經(jīng)性梅毒。
4.梅毒螺旋體培養(yǎng)梅毒螺旋體人工培養(yǎng)較困難，且易失去毒力。利用家兔對梅毒螺旋體的易感性，把梅毒螺旋體注射于白兔睪丸內，觀察有無感染跡象，是經(jīng)典的梅毒診斷方法。但由于費用高、檢查時間長等原因不能應用于臨床，目前僅用于科研或保存梅毒螺旋體。
檢驗診斷綜合評價
梅毒的診斷主要取決于血清學試驗。及早、準確地診斷梅毒需要梅毒實驗室的檢測，選擇敏感性和特異性均高的檢測方法非常重要。目前，梅毒的血清學診斷包括初篩試驗和確認斌驗。初篩試驗主要是性病研究實驗室應用性病實驗研究試驗(VDRL)、快速血漿反應素(RPR、VDRLRPR和TRUST)試驗。此類試驗操作簡單，敏感性高，但可出現(xiàn)假陽性，一般作為篩選試驗，進行梅毒的常規(guī)篩查及療效觀察、判斷復發(fā)及再感染。但存在假陽性和假陰性。假陽性主要是自身免疫性疾病、傳染性疾病和妊娠等等因素所致，假陰性主要是早期，晚期梅毒以及前帶現(xiàn)象。因此，在梅毒篩查試驗時，應同時進行原樣和1：2滴度稀釋檢查。確診試驗包括血清熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)、血凝試驗(TPHA)、明膠顆粒凝集試驗(TPPA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫印跡試驗和梅毒螺旋體制動試驗(TPI)等用于特異性IgM、IgG檢查。初步臨床研究表明，特異性IgM可用于診斷新生兒(先天性)梅毒診斷。其他試驗一般作為血清學試驗的完善和補充。近年來，也可用PCR技術檢測蒼白亞種螺旋體的特異DNA片斷，或用免疫印跡法測定與蒼白亞種螺旋體特異抗原組分發(fā)生反應的特異性抗體。