軟下疳的診斷要根據(jù)發(fā)病前的性接觸史，尤其是不潔性交史，典型的臨床表現(xiàn)和經(jīng)過，較短的潛伏期后發(fā)生軟而扁的丘疹、膿皰、潰瘍，單側(cè)性的化膿性淋巴結(jié)炎，直接鏡檢和培養(yǎng)檢出杜克雷嗜血桿菌，PCR檢測杜克雷嗜血桿菌DNA，即可作出診斷。
一、細(xì)菌學(xué)檢查
嗜血桿菌屬革蘭氏陰性桿菌，培養(yǎng)條件顯示多形性特征，易染性，此菌無芽孢，無運(yùn)動(dòng)。
1、鏡檢：從軟下疳開放性潰瘍?nèi)〔耐科瑯?biāo)本染色，杜克雷嗜血菌易檢出，未破潰病灶從膿腫或橫痃中穿刺，取其穿刺液涂片標(biāo)本染色也易檢出，更為典型，用美藍(lán)染色或革蘭氏染色等鏡檢用10×100倍油浸觀察。
2、培養(yǎng)檢查：軟下疳菌分離培養(yǎng)較為困難，故在采取病變材料時(shí)應(yīng)注意取軟下疳潰瘍邊緣下貯留膿汁或穿刺橫痃抽吸的膿汁作為檢體，或再用生理鹽水充分洗滌潰瘍底面后，再用生理鹽水濕棉簽涂抹標(biāo)本送化驗(yàn)室培養(yǎng)。
國際上軟下疳的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基一種是gchgs(hammond gonococcal media)，由淋球菌瓊脂培養(yǎng)基加牛血紅蛋白、胎牛血清、萬古霉素及纖維素、氨基酸等組成;另外一種是mhhb(muller-hinton瓊脂，由muller-hinton 瓊脂、馬血、萬古霉素及其他培養(yǎng)成份組成)，上述兩種培養(yǎng)基可以同時(shí)應(yīng)用，以提高陽性率。
菌落常于接種后24-48小時(shí)形成。色灰黃而透亮，直徑約為1-2mm。從菌落處取材作革蘭染色陰性，為成雙的短桿菌，成鏈狀排列。同時(shí)應(yīng)作生化反應(yīng)以鑒定之。主要有：氧化酶試驗(yàn)弱陽性，過氧化酶試驗(yàn)陰性，非卟啉試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，鹼性磷酸酶試驗(yàn)陽性。
杜克雷嗜血桿菌的培養(yǎng)不僅有助于診斷，而且可確定分離的細(xì)菌對抗生素的敏感性，目前已分離出耐抗生素的杜克雷嗜血桿菌。
二、血清學(xué)診斷軟下疳
感染桿克雷嗜血桿菌能產(chǎn)生抗體，通過血清學(xué)檢查，不論是補(bǔ)體結(jié)合，凝集反應(yīng)以及熒光抗體間接法等均可證實(shí)，但尚未推廣，目前認(rèn)為igm抗體敏感性為74%，igg抗體敏感性為94%，其特異性分別為84%和64%。
三、pcr檢測杜克雷嗜血桿菌
此外，鑒別診斷本病常被誤診為生殖器皰疹，生殖器皰疹在皰疹階段出現(xiàn)多發(fā)性，成群生性水皰，檢菌陰性，其次與硬下疳作鑒別時(shí)，需注意梅毒的硬下疳較硬，膿性分泌物少，無痛。以及除外其他急性外陰性潰瘍等。