4.緩沖液洗5min/2次。
5.滴加UltraVBlock，在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色。
(注：孵育不要超過(guò)10分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有5-10%正常羊血清，這一步可以省略。)
6.緩沖液洗5min/2次。
7.滴加一抗工作液37℃孵育1-2小時(shí)。(具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者終決定)。
8.緩沖液洗5min/2次。
9.滴加PrimaryAntibodyEnhancer(增強(qiáng)子)，在室溫下孵育20分鐘。
10.緩沖液洗5min/2次。
11.滴加HRPPolymer(酶標(biāo)二抗)，在室溫下孵育30分鐘。
(注：HRPPolymer對(duì)光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。)
12.緩沖液洗5min/2次。
13.向1mlDABPlusSubstrate(或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen(或AECPlusChromogen)，混勻后滴加到切片上，孵育3-15分鐘。(具體時(shí)間由染色深淺決定。)
14.自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。
免疫組化注意事項(xiàng)
1.正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2.在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括：
(1)固相載體的選擇
許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗體(或抗原)的選擇
將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。
(3)酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇
首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
(4)酶的底物及供氫體的選擇
對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
結(jié)語(yǔ)：以上就是小編為大家介紹的有關(guān)于免疫組化的原理以及免疫組化的一些作用。相信大家看完之后對(duì)此也是有所了解了，也知道免疫組化有哪些注意事項(xiàng)了。因此，在進(jìn)行免疫組化的時(shí)候，則需要注意這些事項(xiàng)哦。
